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提問：降落PCR（Touchdown PCR）的原理？  

回答：Touchdown PCR是指每隔一個循環(huán)降低1°C反應(yīng)退火溫度，直至達(dá)到“Touchdown"退火溫度，然后以此退火溫度進(jìn)行10個左右的循環(huán)。該方法最初出現(xiàn)是為了避開確定最佳退火溫度而進(jìn)行的復(fù)雜的反應(yīng)優(yōu)化過程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量的兩倍差異（每攝氏度造成4倍差異）。因此相對于非正確產(chǎn)物，正確的產(chǎn)物可以得到富集該方法的另一個應(yīng)用是在確定已知序列肽的DNA序列。

具體過程如下：使用兩套與已知序列肽兩末端可能配對的簡并引物，這只需要知道一段長為13個氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各長18個堿基（6個氨基酸），兩者之間有一個堿基以上的間隔。使用簡并引物即可以進(jìn)行“Touchdown PCR"。由這種方法將獲得大量的產(chǎn)物，但因為由肽序列可以知道引物之間的確切距離，所以可以根據(jù)產(chǎn)物的大小來選擇所需要的產(chǎn)物。該方法的優(yōu)點在于可以富集引物與模板正確配對的產(chǎn)物。如果克隆和測需一打PCR產(chǎn)物，將可以確定肽的正確編碼序列，設(shè)計進(jìn)行雜交的寡核苷酸等。該技術(shù)特別適用于由Ser，Lys和Arg（每個有6個密碼子）構(gòu)成的多肽。

 提問：降落PCR的優(yōu)點？

回答：綜合比較普通PCR技術(shù)和最大耐受量聚合酶鏈反應(yīng)，認(rèn)為前者程序簡單，省時，一般的PCR擴(kuò)增儀都可完成，但缺點是退火溫度不適當(dāng)時容易出現(xiàn)假陽性;而最大耐受量聚合酶鏈反應(yīng)雖然程序復(fù)雜，需要擴(kuò)增儀有較大的內(nèi)存，但能非常有效地降低或避免假陽性，且不在理想的工作條件（比如最佳鎂離子濃度）下也可擴(kuò)增出產(chǎn)物。 

這就是降落PCR技術(shù)的優(yōu)點吧。不過我認(rèn)為。如果能用普通PCR技術(shù)擴(kuò)出來的話，盡量用普通的聚合酶鏈反應(yīng)，雖然降落聚合酶鏈反應(yīng)比較省事省力，但是，它在一個很寬的退火溫度里擴(kuò)增，亂七八糟的條帶肯定比較多哈。雖然，電泳可能看不到。

降落PCR的一個優(yōu)點是可以增加某些基因的特異性,不僅我自己在擴(kuò)基因的艱難歷程中,發(fā)現(xiàn)了這一優(yōu)點,而且也推薦給周圍的人,如果常規(guī)PCR循環(huán)程序的基因擴(kuò)增效果不佳,我就來熱啟動加降落PCR.在非特異性背景較高的情況下,這招的確有效,但不絕對。

（參考文獻(xiàn)：一種優(yōu)化的PCR方法 降落PCR擴(kuò)增目的基因
江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志 2002年02期
目的 :嘗試用一種新的PCR方法———降落PCR擴(kuò)增目的基因。方法 :在構(gòu)建人CD137-hIgG1Fc - pCDNA3融合蛋白真核表達(dá)載體以及在檢測HBV多聚酶YMDD變異的過程中運用降落PCR擴(kuò)增目的基因。結(jié)果 :擴(kuò)增出的特異性條帶與目的基因大小一致。結(jié)論 :降落PCR省卻了常規(guī)PCR中摸索最適退火溫度的過程 ,對一些Tm值相近的PCR反應(yīng)可應(yīng)用一套溫度程序擴(kuò)增 ,是一種行之有效的PCR方法。
下載附件：）

提問：溫度梯度PCR功能與降落PCR功能的區(qū)別？如：溫度梯度PCR,如25個循環(huán)的退火溫度為50℃~60℃，40秒；和降落PCR有什么不同之處，退火溫度從60℃~50℃，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低1℃；效果是不是都是一樣？

回答：溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時，為了找到優(yōu)退火溫度，在一臺PCR儀上同時做多管PCR，每一管放在儀器內(nèi)不同列（有的是不同行）上，分別進(jìn)行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分別為50，52，54，56，58，60度），最后看看哪個溫度的效果好?？傊怯脕磉M(jìn)行退火溫度優(yōu)化的。

降落PCR是在同一個PCR管內(nèi)進(jìn)行PCR，只是每個循環(huán)的溫度不同（如每個循環(huán)降1度）。一般兼并引物用這種方法多些。

提問：我的兩條引物說明書的Tm值分別為69℃、62℃，若用降落PCR如何設(shè)定溫度范圍？回答：這兩個TM值相差有點大,一般不要超過三度,我認(rèn)為你的退火溫度就在62,63度左右,你可以先試試,如果你想做降落PCR,那么你可以先用高的退火溫度做幾個循環(huán),然后在換到較低退火溫度做幾個循環(huán),然后再用更低的溫度做剩下的循環(huán),對于你這個,你可以先用65度左右做5個循環(huán),然后在60度左右做5個循環(huán),其余在58度做剩下的循環(huán),只是經(jīng)驗,不一定能出來.

提問：什么情況下需要做降落PCR？

回答：主要是在出現(xiàn)非特異條帶時可以考慮用降落PCR,在高的退火溫度下做幾個循環(huán),這樣擴(kuò)出的產(chǎn)物特異性好,可以做為后續(xù)反應(yīng)的模板,然后再溫度較低的情況下以前面擴(kuò)出來的較特異的產(chǎn)物做模板,這樣不但特異性好,而且產(chǎn)物也夠多,可以出現(xiàn)很好的結(jié)果。

還有就是在剛合成引物還未經(jīng)鑒定效果的時候,可以用降落PCR ,但是正如上面說的你的兩個引物的TM值相差的有點大,一般降落是在TM值以下3-5度開始將,每個循環(huán)降0.5或1度,降差不多十個循環(huán)后,再維持在最后一個循環(huán)的溫度上,不要擔(dān)心最后的循環(huán)數(shù)目不夠,其實只要模板量沒問題,二十個循環(huán)足夠了。

提問：剛合成的引物用降落PCR的原因是什么??？

回答：因為理論計算的TM值用來確定退火的溫度只是一個參考呀,最合適的退火溫度會因為各種原因而有所差異,就連PCR儀都會有影響的,我們實驗室就是,好多都是在一臺能拉出條帶,而在另一臺上就拉不出條帶,或者相反的。

降落（TD）PCR代表了一種全不同的PCR優(yōu)化方法。由于開始時的退火溫度選擇高于估計的Tm值，隨著循環(huán)的進(jìn)行，退貨溫度逐漸降到Tm值，并最終低于這個水平。此策略有利于確保第一個引物－模板雜交事件發(fā)生在最互補的反應(yīng)物之間，即那些產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度最終會降到非特異性雜交的Tm值，但此時目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開始幾何擴(kuò)增，在剩下的循環(huán)中處于超過滯后（非特異性）PCR產(chǎn)物的地位。有人研究發(fā)現(xiàn)一些本來產(chǎn)生滿意的單一擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)采用TD PCR時變得更好進(jìn)行了。

提醒一下，如果說明書上的Tm值和Oligo或者Primer上分析的差別挺大的，你要以軟件上的計算為準(zhǔn)。 我覺的你兩個引物Tm值差的太多，不過你也可試。68度開始，每個循環(huán)下降0.5度，或者0.2度，最后62度來個20循環(huán)。

提問：請?zhí)峁┮粋€標(biāo)準(zhǔn)的Touchdown PCR程序。

回答：如下——

ANNEALING TEMP. 55度
94 5min

94 30s
60 30s
72 1min 2cycles

94 30s
59 30s
72 1min 2cycles

94 30s
58 30s
72 1min 2cycles
........

94 30s
51 30s
72 1min 2cycles

94 30s
50 30s
72 1min 20cycles

72 5min

你也可以做Stepdown
原理同上，就是把降落的梯度增加，以三度為宜。

另一個程序：

94C 4min
94c 5sec
70c 10sec
72c *sec 30個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5c
94c 5sec
55c 10sec
72c *sec 15個循環(huán)
72c 7min
延伸時間要看你擴(kuò)增的片斷的長度定，最好先做一個剃度pcr測一下退火溫度的范圍，然后再做touchdown，這樣更有的放矢。